光学显微镜
2024-04-12(513)次浏览
光学显微镜使用可见光进行照明，用光学透镜进行聚焦，人眼或者 CCD/CMOS 相机进行观察。基本的明场照明显微镜由光源，目镜，物镜，载物台，聚光镜，光圈等部件组成。收到衍射效应的限制，光学显微镜的分辨率极限, 其中 NA 是数值孔径(Numerical Aperture)，为物镜与样品间介质折射率以及孔径角正弦值的乘积 ，是光学显微镜重要的参数之一。阿贝极限将光学显微镜的分辨率限制在约200纳米处。 为了提高显微镜的成像素质，扩展应用范围，光学显微镜经过不断的发展改进，已经成为一个庞大的家族。
成像手段：普通宽场成像 (Wide field) ：光学显微镜基本的成像光路全内反射荧光(TIRF)：利用光在介质界面发生全反射，在表面形成倏逝波的特性，只对样品表面 200nm 左右深度内进行成像，隔绝来自焦外光线的干扰。共聚焦(Confocal)：利用空间针孔对焦外光线进行隔绝，对样品进行逐点扫描成像，大大提高z轴分辨率。多光子(Multi-Photon)：利用长波长的光波绕射能力强，穿透能力高的特性，让荧光分子同时吸收多个长波长光子激发短波长荧光，从而实现使用较低能量的光照来对厚样品成像。目前成像的深度已经达到毫米级别。光片 (Light sheet)：对垂直于物镜光轴的切片进行照明，避免了对焦外部分样品的照明，大大提高z轴分辨率，同时相对 confocal 成像速度更高。结构光 (Structured light)：将照明光进行正弦调制或其它形式的调制形成结构光照明，与样品表面形成摩尔纹，使得一部分高频信息能够被观察到。这种方法高能够提升两倍的分辨率，属于一种超分辨技术。受激发射损耗 (Stimulated Emission Depletion, STED)：荧光显微镜中，激发光由于衍射效应，在样品上形成的是一个亮斑，亮斑内的荧光分子均被激发产生荧光，STED在激发光上嵌套一个环形光，使对应环形区域的分子发生受激辐射而不产生荧光，只有中心区域分子产生荧光，从而突破衍射极限限制的分辨率。STED的分辨率可以达到30nm左右。随机光学重构 (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)：随机激发单个荧光分子，对其光斑进行拟合得到中心分子的位置，不断随机激发分子并将得到的图案叠加，得到超越衍射极限分辨率的图像。STORM的分辨率可以达到20nm左右。
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