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光学显微镜

2024-04-12(966)次浏览

  光学显微镜使用可见光进行照明,用光学透镜进行聚焦,人眼或者 CCD/CMOS 相...

光学显微镜使用可见光进行照明,用光学透镜进行聚焦,人眼或者 CCD/CMOS 相机进行观察。基本的明场照明显微镜由光源,目镜,物镜,载物台,聚光镜,光圈等部件组成。收到衍射效应的限制,光学显微镜的分辨率极限, 其中 NA 是数值孔径(Numerical Aperture),为物镜与样品间介质折射率以及孔径角正弦值的乘积 ,是光学显微镜重要的参数之一。阿贝极限将光学显微镜的分辨率限制在约200纳米处。 为了提高显微镜的成像素质,扩展应用范围,光学显微镜经过不断的发展改进,已经成为一个庞大的家族。


成像手段:普通宽场成像 (Wide field) :光学显微镜基本的成像光路全内反射荧光(TIRF):利用光在介质界面发生全反射,在表面形成倏逝波的特性,只对样品表面 200nm 左右深度内进行成像,隔绝来自焦外光线的干扰。共聚焦(Confocal):利用空间针孔对焦外光线进行隔绝,对样品进行逐点扫描成像,大大提高z轴分辨率。多光子(Multi-Photon):利用长波长的光波绕射能力强,穿透能力高的特性,让荧光分子同时吸收多个长波长光子激发短波长荧光,从而实现使用较低能量的光照来对厚样品成像。目前成像的深度已经达到毫米级别。光片 (Light sheet):对垂直于物镜光轴的切片进行照明,避免了对焦外部分样品的照明,大大提高z轴分辨率,同时相对 confocal 成像速度更高。结构光 (Structured light):将照明光进行正弦调制或其它形式的调制形成结构光照明,与样品表面形成摩尔纹,使得一部分高频信息能够被观察到。这种方法高能够提升两倍的分辨率,属于一种超分辨技术。受激发射损耗 (Stimulated Emission Depletion, STED):荧光显微镜中,激发光由于衍射效应,在样品上形成的是一个亮斑,亮斑内的荧光分子均被激发产生荧光,STED在激发光上嵌套一个环形光,使对应环形区域的分子发生受激辐射而不产生荧光,只有中心区域分子产生荧光,从而突破衍射极限限制的分辨率。STED的分辨率可以达到30nm左右。随机光学重构 (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM):随机激发单个荧光分子,对其光斑进行拟合得到中心分子的位置,不断随机激发分子并将得到的图案叠加,得到超越衍射极限分辨率的图像。STORM的分辨率可以达到20nm左右。

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