苏州欧米特光电科技有限公司

0512-67061953 173-1582-5640

新闻中心NEWS CENTER

微分干涉对比(DIC)显微镜是如何工作的?

2024-02-02(457)次浏览

  微分干涉对比(DIC)显微镜是如何工作的?DIC显微镜是一种使用偏振滤光器和沃拉...

微分干涉对比(DIC)显微镜是如何工作的?

DIC显微镜是一种使用偏振滤光器和沃拉斯顿棱镜的传统宽视场显微镜。

光源散发出的光会穿过滤光器,变成45°的偏振光。在穿过沃拉斯顿棱镜后,光会被分成垂直偏振分量,其中一个为0°偏振,另一个为90°偏振。聚光镜将光聚集在标本上,再由2束偏振角度不同的连贯平行光线照射到标本上。光线穿过不同的光路长度,因为其穿过样本的路径上可能存在厚度或折射率差异。
最后的结果是,一条光线相对于另一条光线出现相移。垂直偏振光通过物镜和另一个沃拉斯顿棱镜后,重新组合成135°偏振光。根据光路长度的不同,这两束光线的干扰会产生建设性(增亮)或破坏性(变暗)干扰,使得原本用明场显微镜几乎观察不到的结构现在可通过DIC显微镜观察到。
最后,偏振滤光器(也称为分析仪)会将未发生任何相移的直接透射光滤除,其只允许135°的偏振光通过。

微分干涉对比 (DIC) 显微镜

使生物标本的未染色透明结构可见,这些结构在明场照明下难以看到

用DIC造影剂成像的神经元。Neurons_imaged_in_DIC.jpg

本文解释了当使用显微镜对透明、未染色的生物标本进行成像时,微分干涉对比 (DIC) 如何成为明场照明的良好替代方案。标本的明场图像通常缺乏结构和细节,因为局部吸收光的强度变化很小。染色确实会在通过标本后引起光强度的差异,但染色通常可能是有毒的。DIC显微镜利用光程长度和相移的梯度,使透明结构可见。

带有偏振光的浮雕状图像

未染色的标本在明场显微镜中通常看起来不显眼且细节不足。但实际上,它们与醒目的光相互作用,并发生人眼无法检测到的相移。染色会导致振幅偏移和通过的光强度的差异,但大多数情况下,这仅适用于死材料。引起光波振幅变化的标本或其结构称为振幅物体[1]。

微分干涉对比(DIC)显微镜利用光程长度和相移的梯度,使相位物体在用显微镜观察时可见[2]。当光通过时引起相移的标本或其结构称为相位物体[1]。通过这种方式,可以以足够的对比度和分辨率观察活细胞和生物体。DIC产生类似浮雕的图像,其中标本的结构和特征似乎投下了阴影。它们没有光晕伪影,并且由于光学切片的可能性,也可以对相对较厚的标本进行成像。

DIC显微镜技术最早由弗朗西斯·史密斯(Francis Smith)于1947年发明,但随后由乔治·诺马尔斯基(Georges Nomarski)于1952年进一步发展并成为实用的显微镜方法[2]。

对于DIC显微镜,仅使用偏振光来照亮标本。偏振光分散成两条不同的光线,它们位于偏振的正交平面上。这两条光线彼此非常接近。当它们在样品内以不同的方式经历折射或散射时,就会发生不同的相移。如果这些光线重新组合,它们会相互干扰。光现在是椭圆偏振的。这种偏振可以通过分析仪转换为振幅偏移。通过这种方式,可以使波长在1/200(使用相机时甚至为1/1000波长)与整个波长之间的波长差异的相移可见。

在明场中成像的神经元。明场DIC公司在DIC中成像的神经元。

图 1:使用明场和 DIC 对比度成像的神经元。

光波的振荡

对于非偏振光,光波相对于其传播轴在所有方向上振荡。然而,在线性偏振光中,所有波振荡都具有相同的偏振角度或偏振平面。圆极化是另一种可能的极化类型。光波振荡遵循圆周运动并具有稳定的值,而方向则以恒定的角速度变化。椭圆偏振光是线性偏振光和圆偏振光的混合物。

偏振光可以由称为偏振器的材料或设备产生。如果类似的组件用于确定振动平面,则称为分析仪。有吸收式偏振片和分束偏振片。

偏振光示例:线性、圆周或椭圆偏振波(黑色)的组成,由线性偏振分量(红色和灰色)叠加而成。图 2:偏振光示例:线性、圆周或椭圆偏振波(黑色)的组成,由线性偏振分量(红色和灰色)叠加而成。

DIC显微镜中的光路

在DIC显微镜中,偏振光是通过放置在聚光镜前面的偏振器产生的。这种偏振光通过DIC棱镜分裂成两条具有垂直偏振平面的线偏振光,DIC棱镜更广为人知的是沃拉斯顿棱镜。沃拉斯顿棱镜可以在聚光镜的平面上找到。标准的沃拉斯顿棱镜由双折射材料的两个楔块制成,它们在其底座上粘合在一起,并且光轴平行于外表面并相互垂直。

在沃拉斯顿棱镜的部分,45°偏振光被分成两条垂直的偏振光线,角度分别为0°和90°(左)。棱镜的第二部分随后根据偏振改变它们的色散(右)。两条光线在通过聚光镜后变得平行。图 3:在 Wollaston 棱镜的部分中,45° 偏振光被分成两条垂直偏振光线,角度分别为 0° 和 90°(左)。棱镜的第二部分随后根据偏振改变它们的色散(右)。两条光线在通过聚光镜后变得平行。

通过该棱镜的偏振光被剪切成两个间隔很近的波,具有不同的偏转角度:普通波和非凡波。它们具有垂直的偏振平面,对于这两个波,介质的行为就好像它实际上具有单个折射率一样。波前的剪切发生在位于两个棱镜之间折射率结点的干涉平面上。光波在空间上被剪切角分开。对于整个棱镜上所有匹配的光波,它们的方向和它们之间的距离是相同的。这两个波之间的空间必须小于显微镜的分辨率极限。

因此,试样被紧密间隔的光波对照亮,这些光波与横向位移平行进入。如果这两种光波与具有不同折射率或不同厚度的试样部分相互作用,则当它们从试样中出现时,它们的光程长度会有所不同。光程长度是光路上两点之间的折射率和厚度的乘积。它与传输时间和光速有关。由于光程长度与光的传输时间有关,因此两个匹配的光波之间会发生相移。

在光波穿过标本后,它们通过另一个沃拉斯顿棱镜重新聚集在一起。现在它们相互干扰,形成椭圆偏振光,然后通过分析仪。只有具有明显偏振平面的光才能通过,因此,对于不同的光波会产生不同的振幅。相移被转换为振幅偏移,从而导致生成的图像中具有不同的光强度。

对于现代DIC显微镜,沃拉斯顿棱镜经常被修改。一个例子是Nomarski棱镜。它也由两个双折射楔块组成,但只有一个楔块与沃拉斯顿棱柱中的楔块相同。另一个是修改的,光轴是倾斜定位的。这种差异导致位于棱镜之外的干涉面。因此,棱镜可以位于物镜的孔径平面之外,使DIC更易于使用。

对于DIC显微镜,相邻物体点的相移差异有助于图像的形成。试样的细节在折射率或厚度方面具有梯度,可以更清晰地显示出来。由于光束彼此垂直偏振,因此通过旋转显微镜载物台可以看到图像的差异。

在进行DIC显微镜检查时,请务必记住不要使用塑料基材、载玻片或盖玻片和标本,因为许多聚合物对光具有去偏振作用,并且经常会扭曲对比度。

非偏振光通过偏振滤光片,然后以 45° 偏振。

图 4:非偏振光通过偏振滤光片,然后以 45° 偏振。通过渥拉斯顿棱镜后,光被分离成垂直的偏振分量,一个偏振度为0°,另一个偏振度为90°。随后,聚光镜将光线引导通过样品。样品由两条具有不同偏振的相干平行光线照射。这基本上会产生两个略微偏移的样品明场图像,一个是 0°,另一个是 90° 偏振光。由于光的偏振不同,这些图像不会产生建设性或破坏性干扰。分离的光线经历不同的光程长度,因为它们穿过样品的点的厚度或折射率可能存在差异。这导致一条射线与另一条射线相比发生相移。垂直偏振的光线穿过物镜后,以135°重新组合成一条偏振光。根据光程长度的差异,两种光线的干涉现在会导致标本区域变亮或变暗,从而使结构看起来在明场照明下几乎看不到。最后,直接透射的光(没有发生任何相移)被 135° 偏振滤光片(也称为分析仪)去除。

小鼠纤维成体(结缔组织细胞)、Transdescantia(野花)和 Micrasterias(绿藻)的 DIC 图像。图5(从左到右):小鼠纤维质体(结缔组织细胞)、Transdescantia(野花)和Micrasterias(绿藻)的DIC图像。用具有不同分裂角度的 Wollaston 棱镜记录的秀丽隐杆线虫(蛔虫)的 DIC 图像。图6:用具有不同分裂角度的沃拉斯顿棱镜记录的秀丽隐杆线虫(蛔虫)的DIC图像。


最新资讯

173-1582-5640

公司地址:苏州市工业园区胜浦路258号26栋厂房